| Abstract: | 探討PEDOT修飾之DNA生物感測器製備方法及其性質測試研究生：李彥哲指導教授：顧野松 指導教授簽名： _____________________________________________________________________一、摘要首先探討對氨基苯甲酸(4-ABA)製程之電極，即將PEDOT/Pt電極聚合對氨基苯甲酸使聚二氧乙烯?吩(PEDOT)表面提供羧酸根，經由交聯劑NHS、EDC的作用使探針DNA能接合於電極，再與互補之目標DNA相互雜交，最後加入電化學指示劑道諾霉素(DNM)，以電化學分析儀感測，實驗後得知聚合4-ABA影響了電極導電性，另外也確立了掃描電壓0.4 V時的感測目標DNA訊號。另外也測試不同的PEDOT聚合圈數後對PEDOT膜的影響，實驗結果為掃描10圈後再聚合4-ABA，表面無裂縫，進行接合探針及目標DNA後感測具波峰。另外研究中也致力於以不同製備方法之電極達到感測目標DNA的目的，測試以牛血清蛋白(BSA)取代4-ABA，藉由BSA嵌入於PEDOT表面上，再以交聯劑與探針DNA接合，達成最後接合目標DNA的目的，實驗結果以BSA加入濃度1 mg/mL，交聯劑選擇戊二醛為實驗條件選擇，經由優化後將BSA前處理進行加熱及對於交聯時間拉長至12小時增加感測，另外也實驗將交聯劑改為甲烯藍(MB)，BSA製程之電極改為此指示劑後有較明顯之訊號，另外也將4-ABA製程之電極浸泡MB後進行訊號的確認及比較_____________________________________________________________________ 二、前言生物感測器即是利用生物元件裝置於感測系統中，最後達到輸出訊號和分析目的，其設計的理念是希望能達到快速、穩定、操作便利、低成本且具高專一、高靈敏度、高選擇性等特性廣泛應用於基因感測、環境檢驗、食品工業、藥品開發等。(Myszka,1999)自從人類開始了基因解讀計畫後，解開基因密碼至今數年的時間，許多研究不斷地致力於尋找不同的技術來檢測生物分子，而研究也演進擴張至醫療保健體系，至今導向個人醫學的發展，演發出的生物晶片配合基因醫學成了一個相當方便的工具。(Barton,2003)其依功能可分為生物感測器及微處理晶片兩種，感測晶片因其有固定DNA、蛋白質等不同的物質，稱之為探針，不同的探針具有不同的功能，也可發展成微陣列晶片，同時處理多點檢測。微處理晶片則是增強處理待測物的程序及最後分析程序，其應用的技術如毛細管電泳技術和實驗室多功能處理晶片(lab-on-a-chip)等。(林明瑜,2008)電化學DNA生物感測器為一種基因感測技術，提供了高靈敏度、體積小等優點，其原理是利用一電極上固定特定DNA片段(單股DNA)稱之為探針DNA(probe)和其互補之DNA進行雜交，由於會有高度的選擇性與互補之DNA相接成DNA修飾電極，並再利用具電化學性質之雜合指示劑如道諾霉素、亞甲基藍等來識別，使最後能達到定性定量的檢測。而藉由這樣的機制發展成DNA生物感測器及DNA芯片，檢測在許多領域的應用如基因診斷、基因分析、快速診斷及醫療應用。DNA固定化為感測器中一重要之步驟常見的方法有三種：吸附法(Byfield,1994)、共價鍵接合法、生物素相互作用，而本研究所使用的方式為共價鍵接合，透過交聯劑使基團以共價鍵的形式連接DNA(Wong,2005)，接合後達到電子傳遞目的。不同的固定化各有其優缺點，共價鍵接合經常被使用，因為共價間接合穩定性高但其有費時及需一些表面處理的問題。(Mascini,2000),(Rui,2010)本實驗研究中之感測器是在白金電極上聚合導電高分子PEDOT，再於導電高分子上修飾羧酸基，藉由EDC及NHS做為表面活性劑與媒合劑來活化羧酸基，接著將一端修飾氨根的單股DNA探針序列以共價鍵結的方式固定於電極表面。最後以電化學分析儀感測與探針序列雜合之目標序列，並添加電化學雜合指示劑來幫助產生電化學訊號。另外研究中測試不同的製備方法來達成感測的目的進行實驗，將BSA嵌入PEDOT表面提供基團經由交聯劑的作用達成接合探針DNA的目的，藉此取代4-ABA，以此概念，進行不同實驗條件的選擇如BSA加入濃度、交聯劑的選擇，初步訂定實驗條件後，再進行實驗的優化，希冀此製備電極能具有較佳的感測。最後也將電化學指示劑更改為甲烯藍(MB)，主要測試BSA製程能否具有感測訊號，另外也將4-ABA製程電極浸泡甲烯藍後感測藉以確認訊號，最後也將兩電極的特點加以比較。三、實驗方法與流程首先實驗中經由感測赤血鹽來比較聚合4-ABA對導電性的差異，另外也對於不同聚合圈數所製備的PEDOT/Pt電極，由SEM觀察結構，也將不同PEDOT聚合圈數製備電極，聚合4-ABA後由SEM觀察是否降低裂縫產生。圖一為4-ABA製備電極之流程圖。 圖一 4-ABA製備之電極流程圖另外實驗中以BSA取代4-ABA提供基團之電極稱之為BSA製備之電極，配置不同濃度的BSA，由最終感測決定製程最適濃度，也實驗戊二醛、甲醛為交聯劑之比較，透過BSA加熱前處理及交聯時間不同的優化增加電極之感測，最後實驗浸泡指示劑改為甲烯藍(MB)，將兩種不同電極分別感測，圖二為BSA製程之電極流程圖。 圖二 BSA製備之電極流程圖四、實驗結果與討論4.1 4-ABA製程電極導電性差異 圖三 聚合4-ABA之赤血鹽感測比較圖由圖三中可知原製備之PEDOT/Pt電極具有較佳之導電性，而當電極經由4-ABA的修飾之後，雖為了接合探針DNA提供了共價鍵所需的基團，但卻也因此降低了電極的導電度。4.2 確認感測訊號由圖四中，電極ds/4-ABA/PEDOT/Pt具有與其他步驟電極不同的感測波峰，掃描電壓約0.4 V時具有很明顯的波峰，電流約為1.8e-4A，推測具有雜交後的目標雙股DNA之電極，能使道諾霉素嵌入其中，進而放大電化學的感測訊號，故確立了掃描電壓約0.4 V時所產生的波峰。故將此作為研究中後之不同製程比較參考之依據，並且利用4-ABA製程之電極作為文章後續加以比較製程的時間、波峰大小為標的。 圖四 4-ABA製程各步驟之電極感測比較4.3 PEDOT膜之探討由文獻中指出4-ABA製程之電極會有電極裂縫的問題(賴孟村,2007)，為了改善裂縫問題，文獻中已經對於4-ABA聚合電壓有所探討(吳森迪,2011)，故於研究中，將聚合PEDOT掃描圈數由原本5圈增加為10圈及20圈，經由增加聚合EDOT的掃描圈數，實驗是否能使PEDOT聚合於Pt表面時更加縝密，藉由SEM觀察結構圖。另外將不同掃描圈數的PEDOT/Pt電極再進行聚合4-ABA，經由SEM觀察其結構。 圖五 PEDOT/Pt表面結構圖(聚合圈數20圈) 圖六 PEDOT/Pt表面結構圖(聚合圈數10圈)將聚合EDOT的圈數改為聚合10圈及20圈後，由圖五可觀察聚合20圈所製備的PEDOT/Pt電極，整體結構呈現許多層層的堆疊所形成不規則結構的皺摺波浪狀，非常的不平整且有許多的裂縫，推測所使用的白金絲規格下，對於聚合PEDOT的圈數若過多，會導致PEDOT的表面崩裂後仍在不斷地進行聚合，而將聚合圈數改為10圈後，由圖六可觀察出，不規則的堆疊已經消失了，取而代之的是較平整表面上許多顆粒狀，也沒有裂縫的產生。 圖七 PEDOT/Pt電極聚合20圈後聚合4-ABA結構圖 圖八 PEDOT/Pt電極聚合10圈後聚合4-ABA結構圖由圖七中觀察，聚合圈數調整為20圈後，再行聚合4-ABA，整體的結構依然呈現不規則的結構，表面仍然是崩裂的狀態，無法達到降低裂縫的目的。再由圖八中觀察，聚合圈數10圈，再行聚合4-ABA，綜觀結構可以發現電極表面很多顆粒狀的結構，也有些地方呈現塊狀的呈現，顆粒狀的結構更為明顯，表面無碎裂、碎片的結構，而是依然為顆粒狀的表面結構，無裂縫。 圖九 PEDOT/Pt聚合圈數10圈之感測圖圖九中可看出掃描電壓約0.4 V具有波峰的產生，經由數據處理後，得知掃描10圈之感測電流較5圈多了約0.6e-4A，故由前所知降低了裂縫，增加了感測的導電度，但掃描10圈之波峰高約為掃描五圈的一半，說明了聚合4-ABA的效果降低影響探針DNA的接合，推測可對聚合4-ABA的步驟同時也進行修改。4.4 BSA製程之電極首先實驗製備所需加入之BSA濃度，結果顯示BSA添加量為1mg/mL時，峰高較大。另外對於交聯劑測試了EDC及NHS、甲醛、戊二醛，由實驗結果，EDC及NHS由於實驗交聯官能基之不同，無法達成有效的交聯目的，甲醛及戊二醛的感測波峰峰高雖然相近，但由於甲醛於本次實驗中的再現性並不佳，故從本次實驗中選擇戊二醛當作之後使用之交聯劑。(Marquie,2001)也對於BSA前處理加熱溫度，由原本的不加熱處理無感測訊號，調整為經加熱處理後，表一中當溫度提高為100℃後整體的峰高跟電流值都有所提昇，推測可能加熱溫度更高使蛋白質解鏈的更完全，因而使較多的氨基裸露於PEDOT的表面，增加了探針DNA的接合，而整體電流值的提升，推測可能因BSA加熱溫度提高，解鏈效果提升，增加了電極表面的電子傳遞，而兩個溫度相比較可知選擇BSA前處理溫度100℃，使得最後得到較佳感測的效果。. 數值BSA加熱溫度 波峰位置(V) 波峰電流(μA) 峰高(μA)70℃ 0.381 105.9 2.3100℃ 0.405 124.5 2.7表一 不同BSA前處理加熱溫度感測影響從表二的整理中可知，隨著浸泡時間拉長12hr時，波峰的呈現最佳，故選擇此電極之交聯時間訂為12hr數值交聯時間 波峰位置(V) 波峰電流(μA) 峰高(μA)2hr 0.381 105.9 2.36hr 0.436 119.2 3.412hr 0.423 115.9 4.6表二 改變交聯時間感測比較4.5指示劑改為MB後BSA製程之電極感測此實驗主要是將電化學指示劑改為甲烯藍後，以BSA製程之電極浸泡MB後能否感測出訊號，故實驗一樣以BSA加入量為1mg/mL、交聯劑為戊二醛、交聯時間12hr等前節實驗所決定的較佳之實驗條件進行實驗，最後浸入MB後，最後進行DPV感測並加以比較感測圖。 圖十 電極無盡泡MB之感測圖 圖十一 交聯劑為MB之感測圖圖十為DJ2/DJ1/BSA/PEDOT/Pt電極無浸入MB後進行DPV感測，可發現無浸泡電化學指示劑MB，沒有感測波峰，而圖十一為將BSA製程之電極浸入MB溶液中，再進行DPV感測，從圖中可以發現，與文獻中所知道的MB感測波峰掃描電壓約在-0.25 V(Pinar,2002)(Shana,1997)，此掃描電壓下的確出現明顯波峰，故推測以BSA製程之電極在浸泡MB後，能產生感測波峰。 圖十二 無加入BSA之電極感測結果由圖十二中不加入BSA之製備電極，浸入MB後的感測訊號無法感測出波峰，故推測在不加入BSA的情況下的確影響了電極探針DNA的固定化，無法透過交聯劑與PEDOT表面基團作用形成鍵結，故導致最終無法感測，更加確立此電極的感測效果。 圖十二 4-ABA製程電極浸泡MB感測結果由圖十二中可知，DJ2/DJ1/4-ABA/PEDOT/Pt電極浸泡MB後，掃描電壓約於-0.25 V時也有明顯波峰。由於4-ABA製程之電極為能有效感測目標雙股DNA，所以利用它來測試是否能對於同樣具有電化學指示劑功能的MB產生訊號，由感測結果可知，4-ABA之電極對於浸入MB之後的DPV感測，能有效的產生訊號，故也因此確立可於BSA製程之電極最後浸入電化學指示劑MB的確能有效的感測目標雙股DNA。五、文獻回顧1. Byfield,M.P.and Abuknesha,R.A. (1994). Biochemical aspects of biosensors. Biosensors&Bioelectronics, 9(373).2. Elicia L.S. Wong, Freya J. Mearns, Justin J. Gooding. (2005). Further development of an electrochemical DNA hybridization biosensor based on long-range electron transfer. Sensors and Actuators B , 111-112(7).3. Marco Mascini • Ilaria Palchetti • Giovanna Marrazza. (2000). DNA electrochemical biosensors. Fresenius J Anal Chem , 369, pp. 15-22.4. Marquie?, C. (2001). Chemical Reactions in Cottonseed Protein Cross-Linking by Formaldehyde, Glutaraldehyde, and Glyoxal for the Formation of Protein Films with Enhanced Mechanical Properties. Journal of agricultural and food chemistry, 49(10), p. 4676?4681.5. Myszka*, D. G. (1999). Improving biosensor analysis. JOURNAL OF MOLECULAR RECOGNITION, 12, pp. 279–284.6. Pinar Kara, Kagan Kerman, Dilsat Ozkan, Burcu Meric, Arzum Erdem,. (2002). Electrochemical genosensor for the detection of interaction. Electrochemistry Communications, 4, pp. 705-709.7. Rui Ren a,b , Cuicui Leng b , Shusheng Zhang. (2010). A chronocoulometric DNA sensor based on screen-printed electrode doped with. Biosensors and Bioelectronics, 25, pp. 2089–2094.8. Shana O. Kelley and Jacqueline K. Barton*. (1997). Electrochemistry of Methylene Blue Bound to a DNA-Modified. Bioconjugate Chem, 8, pp. 31-37.9. T Gregory Drummond1, Michael G Hill2 & Jacqueline K Barton1. (2003). Electrochemical DNA sensors. Nature biotechnology, 21(10).10. 吳森迪,顧野松. (2011). 探討DNA電化學感測器之製程及其於DNA分析之應用. 東海大學.11. 林明瑜、蕭在莒、林群倫、蕭程允、陳文逸、楊裕雄. (2008). 下一波生物感測器發展現況與趨勢. 科儀新知, 30(3), 頁 64-72.12. 賴孟村,顧野松. (2007). DNA生物感測器製備及其於DNA分析之應用. 東海大學..
AbstractRecently, biosensor has been widely studied with its high specificity and sensitivity. Many of these studies employ the electrochemical approach to constructbiosensors. The major purpose of this study is to synthesis poly(3,4-ethylenedioxythiophene) (PEDOT) biosensor, where the constructive polymer PEDOTiselectrochemically polymerized on a platinum wire. Therefore, we have investigated preparation condition by carrying outdifferent modification methods in order to reach the goal of DNA sensing.First of all, we have discussed the modification of PEDOT/Pt electrodeby 4-aminobenzoic acid (4-ABA) which could provide carboxylic acid on PEDOT’s surface, Then, we used NHS and EDC surfactantsto attach the probe DNA, to achieve the hybridization with a target DNA. Finally, we immersed the electrode in a daunomycin(DNM) solution to let the electrochemical active DNM interact into the double strand DNA, and detect DNA by differential pulse voltammetry (DPV) with an electrochemical analyzer. Meanwhile,we have exploreddifferentPEDOT polymerizationfocusing on the impacts of the polymerization of 4-ABA on the PEDOT filmOn the other hand, this study has also devoted in preparing electrodes by different preparation methodsin order toimprove the sensing ofa target DNA. Therefore, weapplied Bovine serum albumin(BSA),replacing to achieve modification process .We expected that could be embeddedon the surface of PEDOT, andassist the attachment of the probe DNA,and finally improve binding of the target DNA. In conclusion, an electrode fabricationprocess has been investigated by many different experimental conditions, and we have discussedwhether the processes can improve the sensing of DNA.key words: electrochemical biosensor、PEDOT、daunomycin、methylene Blue、BSA、hybridization。 |
